Home >>  Chuyên ngành  >> HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT XUẤT HẠT BƯỞI

HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CHIẾT XUẤT HẠT BƯỞI

07/11/2017

     Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm từ chiết xuất hạt bưởi (Citrus paradisi Macf., Rutaceae) chiết xuất bằng cồn được kiểm tra với 20 chủng vi khuẩn và 10 chủng nấm men. Hàm lượng tối thiểu để kháng khuẩn (MIC) được thiết lập thử nghiệm in vitro (trong phòng thí nghiệm) và test độ nhạy trong pha loãng dung dịch chuẩn. Khi xác định bằng phân tích trắc phổ chiết xuất bằng ethanol, hàm lượng polyphenol tổng số đạt 3.92% và flavonoid đạt 0.11%, sự xuất hiện flavonon naringin và hesperidin trong chiết xuất được xác định bởi phương pháp TLC. Chiết xuất này có hiệu lực kháng khuẩn mạnh nhất đối với Salmonella enteritidis (MIC 2.06%, m/V) và những chủng vi khuẩn, nấm khác nhạy với nồng độ từ 4.13% to 16.50% (m/V).

     Chiết xuất hạt bưởi (GSE – Grapefruit Seed Extract) là một sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ hạt và thịt quả bưởi (Citrus paradisi Macf., Rutaceae). Các nghiên cứu cho thấy chúng chứa nhiều flavonoid, ascorbic acid, tocopherols, citric acid, limonoids, sterols và khoáng chất chứa trong thịt và hạt quả. GSE được xem là có tính kháng khuẩn mạnh, nó có thể giúp ngăn gia tăng Candida là một loại nấm men ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa. Hiệu quả kháng khuẩn, cơ chế tác động và độc tính của GSE thương mại đã được khảo sát gần đây. Nghiên cứu cho thấy chiết xuất làm phá vỡ màng tế bào làm phóng thích nội bào ra môi trường ngoài trong 15 phút. Nghiên cứu trong ống nghiệm (in vitro) mới nhất cho thấy dung dịch chiết xuất bưởi trong glycerol 33% có tác dụng kháng nấm mạnh đối với các chủng nấm men và có hoạt tính thấp hơn với nấm ngoài da và mốc.

     Các sản phẩm GSE thông thường trong dung môi 33% nước-glycerol, thường được dùng theo phương pháp tự nhiên, thực phẩm bổ sung tự nhiên, là chất khử trùng cũng như chất bảo quản trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các sản phẩm thương mại thường có chứa các tác nhân như benzethonium clorid, triclosan và methyl parabene khiến các kết luận về tác dụng của GSE bị đánh giá sai. Vì vậy GSE được chiết xuất bằng cồn được đánh giá xác định tác động kháng khuẩn và kháng nấm cho kết quả đáng tin cậy hơn.

     Thử nghiệm

     Mẫu thử: nguyên liệu bột khô (từ thịt quả và hạt, tỷ lệ 4:1) được chiết xuất với cồn 70% trong 6 giờ bằng phương pháp Soxhlet. Sau khi làm lạnh, dung môi được loại bỏ bằng cô quay để bay hơi. Đối với thử nghiệm vi sinh, chiết xuất 33% (m/V) được dùng với ethanol 70%.

     Phân tích quang phổ: phân tích TLC được tiến hành trên Kieselgel 60 F254 (bản nhựa dày 0,2mm, hàng Merck, Đức) sử dụng dung môi pha động là ethyl acetate/formic acid/acetic acid/ nước (100:11:11:27, V/V). Để nhìn thấy flavonoid và phenolic acid bằng cách phun lên tấm sắc ký bằng dung dịch methanol 1% diphenylboric acid aminoethyl ester, sau đó phun dung dịch ethanol 5% polyethylene glycol 4000, chiếu dưới tia cực tím ở 365nm. Để mục đích tham khảo sử dụng naringin và hesperidin (Roth, Đức). Hàm lượng polyphenol tổng số trong chiết xuất thô được xác định bằng phương pháp Schneider liên quan đến phản ứng Folin-Chiocalteu và tiêu chuẩn acid tannic, các phân tích thực hiện ở bước sóng 720nm. Xác định hàm lượng flavonoid trong chiết xuất ethanol thô được thực hiện theo Dược điển Châu Âu. Sau khi thủy phân bằng acid, flavonoid aglycones hình thành được xác định bằng quang phổ tại bước sóng 425nm với AlCl3. Hàm lượng flavonoid trong chiết xuất được tính như hyperoside, phương pháp đo được tiến hành bằng quang phổ kế Helios Gamma & Delta UV-Visible (Spectronic Unicam, UK).

     Thử nghiệm vi sinh

     Thử nghiệm được thực hiện trên 10 chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus cereus ATCC 11778, B. subtilis NCTC 8236, Sarcina flava MFBF*, S. lutea ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 6538P, S. aureus ATCC 29213, S. epidermidis MFBF*, Enterococcus faecalis ATCC 20201, Streptococcus sp. MFBF*, Listeria monocytogenes MFBF*) và 10 chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli O:157 MFBF*, E. coli O:128 MFBF*, Shigella sonnei MFBF*, Salmonella enteritidis MFBF*, Yersinia enterocolitica O:9 MFBF*, Citrobacter freundii MFBF*, Klebsiella oxytoca MFBF*, Proteus mirabilis MFBF*, P. vulgaris MFBF*, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27895), và thêm 10 chủng nấm men (Candida albicans MFBF* 1, C. albicans MFBF* 2, C. albicans MFBF* 3, C. krusei MFBF*, C. krusei MFBF* K1, C. tropicalis MFBF, C. tropicalis MFBF* T1, C. parapsilosis MFBF*, Saccharomyces cerevisiae MFBF* V1, Kluyveromyces maxianus MFBF CC4).

     Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn dựa trên phương pháp khuếch tán Agar và phương pháp pha loãng nồng độ. Phương pháp khuếch tán Agar được thực hiện theo dược điển Châu Âu. Thử nghiệm vi khuẩn với mật độ 104 – 105 tế bào (0.5ml) được quét trên môi trường thạch cứng Müeller Hinton đối với vi khuẩn và môi trường thạch Sabouraud dextrose agar đối với nấm men. Thể tích cấy là 25 và 50µl chiết xuất, đối chứng âm là ethanol 70% ở cùng thể tích. Sau 2 giờ ủ khuếch tán ở 4oC, các đĩa thạch được ủ ở 37oC trong 18 tiếng đối với vi khuẩn và 25oC đối với nấm men. Đường kính ức chế tăng trưởng được đo sau đó.

     Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC được đánh giá bằng test pha loãng nồng độ. Các thí nghiệm nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng chứa chiết xuất thử nghiệm được pha loãng dần ủ ở 37oC đối với vi khuẩn và 25oC đối với nấm men. Hai ống nghiệm cuối cùng chỉ chứa môi trường dinh dưỡng và ethanol 70%. Một mẫu được coi là không có vi khuẩn sinh trưởng nếu môi trường dinh dưỡng vẫn trong suốt sau khi ủ 18 tiếng. Nồng độ ức chế tối thiểu của chiết xuất (m/V) ngăn môi trường dinh dưỡng bị đục được xem là MIC. Tất cả các mẫu không có độ đục được đưa vào môi trường Müeller Hinton hoặc Sabouraud agar. Nồng độ thấp nhất của chiết xuất khiến vi sinh vật không phục hồi và phát triển khi chuyển sang môi trường mới là nồng độ diệt khuẩn tối thiểu – minimal microbicidal concentration (MMcC).

     Kết quả

     Kết quả đo quang phổ cho thấy chiết xuất ethanol thô của hạt và thịt quả bưởi chứa 3.92 ± 0.40% polyphenol tổng số (x ± SD, n = 3), hàm lượng flavonoid là 0.01-0.02% (x ± SD, n = 3). Phương pháp TLC xác nhận có sự xuất hiện của flavonon là naringin và hesperidin trong chiết xuất.

     Chiết xuất 33% (m/V) hạt và thịt bưởi (GSE) trong cồn được sàng lọc khả năng kháng khuẩn với 20 chủng vi khuẩn và 10 chủng nấm men trên nền agar (bảng 1), mẫu kiểm soát bằng ethanol 70% không có vòng kháng khuẩn.

     Khảo sát cho thấy chiết xuất tiêu diệt tất cả các dòng vi khuẩn Gram dương, nhưng không ảnh hưởng gì đến vi khuẩn Gram âm. GSE có khả năng ức chế Listeria monocytogenes (16 mm), Streptococcus faecalis (15 mm) và Bacillus subtilis (14 mm). Chiết xuất GSE cho thấy ức chế yếu hơn (vòng kháng khuẩn 10-12mm) ở các chủng Bacillus cereus, Sarcina flava, S. lutea, Staphylococcus aureus, S. epidermidis and Streptococcus sp. MFBF. Dữ liệu cho thấy GSE ức chế tất cả các dòng nấm men được kiểm tra, vừng ức chế 13mm ở Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces maxianus Candida tropicalis MFBF, Candida tropicalis và hai chủng C. krusei có vòng ức chế 12mm. Hoạt tính kháng nấm thấp nhất của GSE có vòng kháng khuẩn từ 9-11mm ở chủng nấm Candida albicans.1     

     Bảng 1 cũng cho thấy kết quả pha loãng tới hạn, trong đo GSE được thử nghiệm (33%, m/V) được pha loãng lên tới 0.06% (m/V). Trong môi trường dinh dưỡng GSE có hiệu quả kháng khuẩn có khả năng kháng tất cả vi sinh vật kể cả vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn được kiểm nồng độ chiết xuất từ 2.06% đến 16.50% (m/V). Ảnh hưởng mạnh nhất của chiết xuất lên Salmonella enteritidis (MIC 2.06%, m/V), Listeria monocytogenes, các chủng StreptococcusEscherichia coli bị ức chế bởi 4,13% (m / V) GSE. Bacillus cereus, B. subtilis, Sarcina flava, S. lutea, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Shigella sonnei, Yersinia enterocolitica, Klebsiella oxytoca Pseudomonas aeruginosa bị ức chế ở nồng độ cao hơn MIC 8.25%, m/V. Giá trị MIC cao nhất ở các chủng Citrobacter freundi, Proteus mirabilis P. vulgaris với MIC 16.50% (m/V). GSE kháng nấm ở tất cả các chủng nấm men trong MIC từ 8.25% đến 16.50%, các chủng Saccharomyces serevisiae, Candida krusei và 2 chủng C. albicans có độ nhạy cao hơn các chủng nấm khác.

2.    

      Bảng 2 thể hiện các kết quả phép đo ở nồng độ pha loãng môi trường. Như đã thấy nồng độ chiết xuất 16.5% m/V được xem là chất diệt khuẩn, diệt nấm cho tất cả vi sinh vật được kiểm tra. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của GSE trong bảng 1 được xem là chất diệt khuẩn cho hầu hết các chủng vi sinh vật được thử nghiệm, ngoại trừ Bacillus cereus, B. subtilis, Sarcina flava Escherichia coli. Ở các trường hợp này do vi khuẩn chịu được chiết xuất.

     Kết quả cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữ hiệu quả chống vi khuẩn giữa GSE tự làm và một số sản phẩm thương mại hiện có ở báo cáo trước (14-16). Mặc dù thực tế cho thấy chiết xuất thương mại có hoạt tính cao hơn nhiều so với sản phẩm chiết xuất cồn tự thực hiện, nhưng vẫn có hoạt tính nhẹ kháng nấm về vi khuẩn.

     Kết luận

     Các kết quả được báo cáo ở đây đóng góp kiến thức về hiệu quả kháng khuẩn của chiết xuất hạt bưởi, nó đã được chứng minh rằng chiết xuất hoàn toàn tự nhiên từ hạt và thịt quả bưởi bằng ethanol ảnh hưởng đáng kể lên các vi khuẩn và nấm men được thử nghiệm. Nhưng ít hiệu quả kháng khuẩn hơn so với một số chế phẩm thương mại trong tài liệu trước. Sự khác biệt này có thể do  hàm lượng polyphenol và đặc biệt là flavonoid. Điều này cho phép kết luận tính kháng khuẩn và kháng nấm của các sản phẩm thương mại hiện có không nhất thiết do sự có mặt của các chất bảo quản tổng hợp như một số tác giả khác cho biết.

     Công ty Amigos dẫn tin theo nguồn Antimicrobial activity of grapefruit seed and pulp ethanolic extract, Zdenka Cvetnic, Sanda Vladimir-Knezevic.